蛋白提取

大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液, 少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丁醇等有ji溶劑中，因些，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。ELISA是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶 解，縮短提取時間。但另一方面. ,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

染色質免l疫共沉淀技術(ChIP)

基于體內分析而發展的染色質免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技術可以真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l細胞或者組織的方法，因此能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。近年來,這種技術得到不斷的發展和完善。采用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經系統紊亂等疾病主要通路的一-種非常有效的工具。

染色質免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l細胞狀態下，當用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產生共價鍵。細胞內，當F與Promoter相互結合時，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產生共價鍵。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認為是導致STR產生的較為常見原因，并且依據不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發生的概率也不相同。固定的蛋白質DNA復合物通過超聲或酶處理將其隨機切斷為-定長度范圍內的染色質小片段然后通過抗原抗l體的特異性識別反應沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNAl片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

RIP

技術概述

RIP是研究體內蛋白與RNA互作的重要技術。在同樣獲得80M測序數據的情況下，NimbleGen有97%的目標序列達到10x以上的測序深度，而其他產品只有90%。該技術先用甲醛等試劑交聯細胞內的“蛋白-RNA”互作復合物，裂解細胞后，用靶蛋白特異的抗l體(或標簽抗l體)做免l疫沉淀，獲得“靶蛋白-RNA”互作復合物，去交聯分離其中的RNA;針對預測的靶蛋白結合RNA的序列設計引物，

做qPCR實驗，驗證預測的RNA是否與靶蛋白有結合，或者將分離出來的RNA做高通量測序，篩選到可能與靶蛋白結合的RNA。

技術流程

細胞交聯-→細胞裂解-→免l疫共沉淀→去交聯→RNA分離→建庫→高通量測序(或qPCR)。

18.引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設計的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產物50-150bp），但不能與引物重疊。

◆長度一般為18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C 左右。

有用的熒光染料參數